ADAPTAÇÃO DO MODELO DO OVÁRIO ARTIFICIAL PARA A FORMAÇÃO DE BANCO DE GERMOPLASMA DE CUTIAS (Dasyprocta leporina, LINEAUS 1758)
cutia, folículos pré-antrais, MOIFOPA
O objetivo do presente estudo é utilizar a MOIFOPA como ferramenta para o resgate e otimização do uso de gametas femininos oriundos de cutias (Dasyprocta leporina) criadas no bioma caatinga. O presente projeto será dividido em três fases experimentais. Para tanto serão utilizadas 48 fêmeas, provenientes do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. Após eutanásia, os ovários serão coletados e lavados em álcool 70% para retirada de sangue e contaminantes. Na primeira fase, será realizado o isolamento de folículos ovarianos pré-antrais (FOPAS) utilizando dois métodos, o enzimático com a colagenase tipo IV e o mecânico, bem como a associação de ambos. Após o procedimento, os FOPAS serão submetidos ao cultivo in vitro por 7 dias e analisados através viabilidade folicular, atividade mitocondrial e PCR. A fase II será realizada em três etapas experimentais. Na etapa I, será realizado o cultivo in vitro de FOPAS in situ, em diferentes concentrações (0, 10 e 50 ng/mL) de FSH. Na etapa II, será analisado o efeito de diferentes concentrações (0, 10 e 50 ng/mL) de GDF-9. Na fase seguinte, será verificado o efeito do GDF-9 e FSH em associação, utilizando as melhores concentrações obtidas nas fases I e II, durante sete dias de cultivo in vitro. Serão submetidas as mesmas análises da fase I, e ainda, histologia clássica; identificação, localização e quantificação da expressão gênica do fator de crescimento (GDF-9); imunohistoquímica; fragmentação de DNA (TUNEL); integridade da matriz extracelular; níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS); glutationa (GSH) e atividade mitocondrial. Finalmente, na fase III, será realizada duas etapas experimentais. Na fase I, os fragmentos serão expostos às soluções de vitrificação a 4ºC ou temperatura ambiente (37ºC). Na fase II, será realizada a criopreservação de tecido ovariano utilizando o melhor método de vitrificação associado a melhor temperatura de exposição da solução de vitrificação da fase I. Nessa etapa, os fragmentos serão expostos a uma solução de vitrificação suplementada com 0, 0,25 ou 0,5 M de sacarose por 2, 5 ou 10 minutos cada uma. Todas as amostras da fase III, serão submetidas às mesmas análises da fase II. Na análise estatística, os resultados serão expressos como média ± erro padrão. Para todas as análises, o software Statview 5.0 será utilizado com P < 0,05. A partir desta análise inicial, serão estabelecidos os testes estatísticos mais adequados para a comparação das médias e identificação de diferenças entre os tratamentos. Desse modo, espera-se estabelecer o melhor protocolo de isolamento folicular, aprimorar o protocolo de criopreservação e desenvolver um sistema ideal de cultivo in vitro para FOPAS de cutias (Dasyprocta leporina), no intuito de aumentar as taxas de viabilidade folicular e oocitária nas diversas biotécnicas reprodutivas, as quais atuam diretamente na preservação e na multiplicação da espécie.