O herbicida oxyfluorfen, pertencente à classe dos difenil éter, é amplamente empregado em sistemas agrícolas devido à sua eficácia no controle de plantas daninhas. No entanto, seu uso recorrente tem levado ao acúmulo em solos e recursos hídricos, elevando os riscos ecotoxicológicos e ameaçando organismos não-alvo. Frente a essa problemática, a busca por estratégias sustentáveis de degradação, como a biorremediação microbiana, tem se intensificado. Microrganismos são capazes de metabolizar compostos xenobióticos, transformando-os em subprodutos menos tóxicos ou promovendo sua completa mineralização. Diante desse cenário, este estudo teve como objetivo identificar microrganismos e enzimas envolvidos na degradação desse composto, por meio de sequenciamento e abordagem proteômica gel-free shotgun. Cinco microrganismos habitantes de solo anteriormente isolados de campo agrícola com longo histórico de aplicação de oxyfluorfen, foram identificados por meio de sequenciamento dos genes 16S rRNA (bactérias) e ITS/26S rDNA (levedura) como Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Micrococcus luteus, Bacillus paralicheniformis e Moesziomyces aphidis. As análises filogenéticas confirmaram essas identificações, e as sequências foram depositadas no GenBank. Em uma segunda etapa, B. licheniformis ISO 04 foi cultivado em meio mínimo líquido contendo oxyfluorfen nas concentrações de 25 e 50 mg L⁻¹ e, uma curva de crescimento foi determinada. Para as análises proteômicas, a cepa foi cultivada nas mesmas condições por 32 horas, em seguida as proteínas foram extraídas, digeridas com tripsina e analisadas por LC-MS/MS em sistema UHPLC acoplado a Q Exactive Plus Orbitrap. O comportamento de B. licheniformis ISO 04 observado na presença do herbicida revelou uma redução na densidade celular proporcional ao aumento da concentração do herbicida. As análises estatísticas e de bioinformática revelaram alterações significativas em vias metabólicas relacionadas ao metabolismo central e energético, à biossíntese de cofatores e aminoácidos, à resposta ao estresse, à manutenção celular, além de funções ribossômicas e de transporte. Duas enzimas destacaram-se por sua expressão exclusiva nos tratamentos com oxyfluorfen: O-succinilbenzoato sintase e α-acetolactato descarboxilase, sugerindo um papel potencial como biocatalisadoras na degradação do herbicida. Os dados indicam, ainda, a ativação de rotas metabólicas alternativas como estratégia de adaptação ao estresse químico. Esses achados contribuem para o avanço do conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na biorremediação de ambientes contaminados por oxyfluorfen.